BH3-only proteiny – budoucnost léčiv

Hlavním tématem studentské práce Zuzany Klímové z Gymnázia v Brně-Řečkovicích je výzkum proteinů, které jsou podstatou všech živých organismů a základem všech životních procesů. Jde o biopolymery složené z aminokyselin spojených peptidovou vazbou do dlouhých polypeptidových řetězců. Kvalitní zpracování tématu umožnilo Zuzaně, aby se svou prací postoupila do finále soutěže vědecko-technických projektů středoškoláků Expo Science Amavet 2014.

BH3-only proteiny jsou proteiny ze skupiny Bcl-2, která přímo ovlivňuje buněčnou apoptózu. Apoptóza je fyziologická forma buněčné smrti, neboli „programovaná smrt buňky“. Onemocnění z důvodu nesprávné regulace apoptózy jsou např. Alzheimerova a Parkinsonova choroba nebo leukémie. Apoptóza je vysoce regulovaný proces z toho důvodu, aby smrt probíhala ve správném okamžiku a uvnitř správných buněk. Proteiny z rodiny Bcl-2 jsou při apoptóze v centru vnitřního dění.

Apoptóza

Jeden z hlavních způsobů buněčné smrti se nazývá Apoptóza. Řízená smrt jednotlivých buněk je nutná k rozvíjení a fungování mnohobuněčných organismů. Uplatňuje se například v likvidaci poškozených buněk, buněk napadených virem nebo strádajících – nedostatečně zásobených živinami. Proces apoptózy buňky je spuštěn složitou soustavou různých látek, které mohou být jak mimobuněčného původu, tak vnitrobuněčné, tedy produkované uvnitř buňky samotné. Z mimobuněčných molekul může apoptózu spustit například vystavení buňky jedům, hormonům, záření apod. Tyto látky buď proniknou přímo do buňky, nebo spustí biochemickou kaskádu z vnější části cytoplazmatické membrány. Vnitrobuněčná cesta se spouští převážně ve chvíli, kdy je buňka v jakékoliv formě stresu. Poté dojde k šetrnému odstranění zbytků mrtvé buňky (nikoliv k zánětu), čímž se apoptóza liší od nekrózy. Apoptóza je mnohdy pozitivní proces, ke kterému například lidské tělo sahá v průběhu svého vývoje (známým příkladem je proces vzniku prstů tak, že embryonální buňky mezi budoucími prsty spáchají apoptózu). Apoptoticky však umírají i různé poškozené buňky, porucha schopnosti apoptózy může způsobit poměrně široké spektrum onemocnění. Nedostatečná apoptóza může obecně způsobit nadměrné pomnožení buněk, a tak například vést k rakovině.

Protein umí buňce pomoci zemřít i zůstat na živu

Na obr. 1je zjednodušený model regulace apoptózy Bcl-2 proteiny. Každý protein z BH3-only skupiny má specifický mechanismus účinku. Pokud se některý BH3-only protein někdy sváže s anti-apoptotickými proteiny, nazývá se „senziter“. Další BH3-only proteiny byly nalezeny svázány s pro-apoptotickými proteiny a nazývají se „aktivátory“. Nedávno se nicméně zjistilo, že některé BH3-only proteiny se chovají jako senzitery i jako aktivátory. Zatím se přesně neví, co ovlivňuje svázání každého BH3-only proteinu. Ví se však, že část těchto proteinů nazývaná BH3 doména je s těmito interakcemi přímo spojená.
Bcl-2 proteiny sdílejí ve svých sekvencích čtyři podobné regiony nazývané BH domény. Ve své práci jsem se zaměřila na speciální skupinu Bcl-2 proteinů, a to na skupinu BH3-only. „BH3-only“ se nazývají proto, že s ostatními proteiny ze skupiny Bcl-2 sdílejí pouze třetí BH doménu (BH3), a jak jsem se již zmínila, tato BH3 doména byla shledána jako zásadní pro interakci s dalšími proteiny. Některé BH3-only proteiny vědci nazývají zajímavými názvy: Bim, Bmf, Puma, Bid, Hrk, Noxa a Bad.
Cílem mé práce bylo shromáždit všechny informace o BH3-only proteinech a dále se zabývat strukturou BH3-only proteinů. Nejdůležitějším bodem bylo odpovědět na otázku, zda strukturní podobnost BH3-only proteinů koreluje s vazebnými preferencemi zjištěnými v literatuře.

Experimentování pomocí počítače

Protože jsem pracovala pouze s doménami, které vycházejí ze stejných předků, je jasné, že jsou všechny použité sekvence podobné. Přesto zde najdeme mnoho rozdílů. Navíc, pokud je protein získán z rozdílných organismů, mohou být jeho sekvence různé. Je velmi důležité porozumět, jak moc ovlivní sekvenční podobnost moji strukturní analýzu. Proto jsem nejdříve prozkoumala vztah mezi BH3 doménami z jednoho organismu.
Celkem jsem pracovala se sedmi BH3 doménami BH3-only proteinů. Každá z nich obsahovala 15 aminokyselin. Porovnávala jsem od každého proteinu pouze jeden vzorek BH3 domény, a to z myšího organismu. Vzorek z myši byl totiž jako jediný dostupný pro každý protein, a tím jsem se zároveň vyvarovala odchylek v rámci organismů. BH3 domény BH3-only proteinů byly určeny za pomoci výpočetního programu Clustal W 2.
Abych co nejvíce minimalizovala vliv sekvenční podobnosti na svoustrukturní analýzu, zabývám se zde pouze superimpozicí, neboli porovnáním, kde byla použita pouze páteř proteinu (obsahovala molekuly dusíku, kyslíku a uhlíku). K určení strukturní podobnosti jsem využila celkem 27 vzorků struktur BH3-only proteinů z databáze PDB (Protein Data Bank). Tato analýza dokázala, že struktury získané pomocí NMR (spektroskopie nukleární magnetickou resonancí) vykazují vyšší strukturní variabilitu, než by se běžně očekávalo. A dále dokázala, že komplex nebo organismus, ze kterého se vzorek získal, nehraje ve výsledných hodnotách podobnosti žádnou roli.

Tvorba modelů

Protože v použitých BH3 doménách existovalo mnoho strukturních variabilit a nebylo možné přesně kvantitativně určit vliv faktorů, jakobyly např. experimentální okolnosti, bylo nezbytné vytvořit průměrné modely každého proteinu. Modely musely obsahovat základ jednotlivých strukturních rysů každého proteinu. Model byl tedy vytvořen pro sedm BH3-only proteinů, kterými se v této práci zabývám. Pro každý model byly porovnány všechny dostupné struktury za pomocí programu Site Binder a poté byl vygenerován průměrný model (viz obr. 2). V případě proteinu Hrk, byla dostupná pouze jedna struktura, zatímco v případě Bimu zde bylo dostupných 14 struktur. Poté, co jsem získala jeden průměrný model pro každý protein, porovnala jsem těchto sedm modelů jeden vůči druhému v oddělené analýze. Nakonec jsem analyzovala strukturu průměrných modelů jednotlivých BH3-only proteinů s vazebnými preferencemi proteinů. Informace o vazebných preferencích jsem získala z několika zdrojů, každý vzorek byl získán pomocí velmi odlišného pokusu.

Výsledky analýz a přínos pro praxi

Moje výsledky dokazují, že míra strukturní podobnosti ve 3D prostoru koreluje se specifičností vazeb. I když získané výsledky se musí dále pročistit, může být tato analýza užitečná při rychlém posuzování specifického účinku léčiv, jejichž 3D struktura je podobná struktuře peptidu. Tato léčiva se v poslední době velmi rozšířila, protože mají velmi široké využití. Moje analýza může jejich výrobu urychlit.
Má studie také výrazně pomůže v rámci vývoje léčiv na nemoci podnícené apoptózou. Na základě výsledků mé studie lze za pomoci jiného elementu – léku se stejnou strukturní podobností – inhibovat proteiny,a tím zabránit buňce podstoupit apoptózu, nebo naopak apoptózu podnítit. Proto je má studievelkým přínosem v programu CEITEC(Středoevropský technologický institut), kde nadále v rámci regulace apoptózy a ostatních buněčných procesů spolupracuji s vědci na dalších studiích.
V dalším kroku se budu snažit o objasnění strukturní podobnosti u dalších proteinů a strukturně zmapovat celý proces buněčné smrti. V budoucnu by se mohlo na základě mých studií docílit námi regulované apoptózy a tak přispět ve vývoji nových terapeutických strategií pro léčení závažných onemocnění, např. rakoviny nebo Alzheimerovy choroby.